Геймплей Геймплей игры стандартен для серии Assassin’s Creed и является развитием игрового процесса Assassin's Creed II. Как и в предыдущих частях, основой механики игры является паркур, использование толпы и различных укрытий для незаметных убийств («стелс») и развитой системы ближнего боя. Открытый мир игры представляет некоторою степень нелинейности прохождения, хотя основные сцены игры и её хронологические рамки выстроены с помощью системы скриптов. Непосредственное прохождение сюжетной линии занимает около 15 часов. Кроме того, к игрокам вернулась возможность переигрывать все сюжетные миссии игры. Действие игры преимущественно происходит в Риме XVI века, однако периодически события переносятся в современность, где главным героем является Дезмонд Майлс (англ. Desmond Miles), обучающийся искусствам ассасина с помощью машины «Анимус 2.0» (лат. anima — душа), позволяющей считывать генетическую информацию о предках Дезмонда и погружать его в прошлое. Главный герой исторической части игры — Эцио Аудиторе да Фиренце (англ. Ezio Auditore da Firenze), один из лидеров и наставников ордена ассасинов. Злейшие враги ассассинов — представители влиятельного клана Борджиа, полностью контролирующие политику Рима и его коррумпированных лидеров. По сравнению с предшествующей игрой, боевая система не претерпела серьёзных изменений. По словам разработчиков, динамика боя стала более активной и наступательной. Теперь поощряется быстрое наступление; контратаки стали менее эффективными. Система поведения NPC стала агрессивной, игрока атакуют сразу несколько противников. Увеличилось количество оружия, появилась возможность использовать стационарные пушки в некоторых игровых ситуациях. Кроме того, серьёзно пересмотрена роль лошади, на которой теперь можно передвигаться и в пределах города. Лошадь участвует в некоторых элементах паркура. В процессе выполнения заданий Эцио встречает и взаимодействует с различными историческими персонажами, такими как Леонардо да Винчи, Никколо Макиавелли, Катерина Сфорца; представители рода Борджиа являются основными противниками игры. Сюжет игры в целом чётко вписан в хронологические рамки.
Сюжет 40-летний Эцио Аудиторе да Фиренце поднялся на вершины иерархии ордена после окончания событий игры Assassin's Creed II. Отомстив убийцам отца и братьев, он покинул Рим и наслаждается жизнью в своей вилле. Действие игры начинается в 1499 году, фамильная резиденция рода Аудиторе Монтериджони (англ. Monteriggioni) осаждена наёмниками семьи Борджиа. Осаду проводит сын Родриго Чезаре Борджиа. В осаде, на глазах у Эцио, погиб его родной дядя Марио. После этого действие игры переносится в 1503 год, где Эцио вынужден организовать и начать развивать "подполье"(В которое входят Римские воры, куртизанки, а далее и рекруты-ассасины), когда начинает возрождаться орден, лидером которого формально был Николло Макиавелли, который после передаст титул Эцио. На протяжении игры Эцио пытается найти убийц своих родственников и отомстить им, а также вернуть Риму былой мир, порядок и процветание. В будущем Дезмонд, Люси, Шон и Ребекка прибывают в Монтериджони. Они должны пройти подземные туннели и устроить укрытие в Святилище под виллой Аудиторе для того, чтобы найти Яблоко Эдема и приостановить надвигающуюся катастрофу. Персонажи Современные персонажи: Дезмонд Майлс — главный герой всей серии игры, ассасин, бывший бармен, потомок Эцио. Впал в кому в конце дополнения «The Da Vinci Disappearance». Люси Стиллман — ассасин, обучает Дезмонда навыкам ассасина. Ребекка Крейн — инженер, построила и улучшила Анимус 2.0. Шон Гастингс — историк, наводит Дезмонду сведения о персонажах, неуклюжий и нервный циник. Уоррен Видик — учёный, тренер убийц Абстерго (появляется только в мультиплеере).
Исторические персонажи: Эцио Аудиторе де Фиренце — главный герой игры, ассасин. Марио Аудиторе — дядя Эцио, ассасин, погиб от рук Чезаре Борджиа. Клаудия Аудиторе — сестра Эцио, ассасин. Мария Аудиторе — мать Эцио. Кристина Веспуччи — возлюбленная Эцио, появляется в воспоминаниях Эцио о ней. Ла Вольпе — друг Эцио, профессиональный вор, ассасин. Николо Макиавелли — друг Эцио, наставник ассасинов. Бартоломео д'Альвиано — друг Эцио, воин, ассасин. Пантасилея Бальони — жена Бартоломео. Леонардо Да Винчи — друг Эцио, художник, изобретатель. Создал парашют для Эцио, а также вернул ему всё потерянное снаряжение. Катерина Сфорца — графиня Форли, любовница Эцио, просит у наёмников помощи в обороне Форли. Филипп де Валуа — барон, французский полководец. Противостоит ассасинам и Чезаре Борджиа. Захватил в заложники Пантасилею Бальони, вследствие чего убит Эцио Аудиторе. Фабио Орсини — кондотьер римской армии. Микелетто Корелья — профессиональный убийца, соратник Чезаре Борджиа. Пьетро — актер, любовник Лукреции Борджиа. Был тяжело ранен вследствие заговора, организованного Микелетто Корелья и Чезаре Борджиа. Родриго Борджиа — папа римский, тамплиер, убит Чезаре Борджиа. Чезаре Борджиа — сын Родриго Борджиа, капитан - генерал папской армии. Атаковал фамильную виллу Аудиторе, убил Марио Аудиторе, украл яблоко Эдема и захватил в плен Катерину Сфорца. На протяжении всей игры является главным антагонистом игры. Убит Эцио Аудиторе. Лукреция Борджиа — дочь Родриго, сводная сестра и, по совместительству, любовница Чезаре. В дополнении «The Da Vinci Disappearance» является герцогиней Форли. Мультиплеер Assassin’s Creed: Brotherhood — первая игра серии, в которой реализован мультиплеер. Как было показано во время побега из штаба организации «Абстерго» (англ. «Abstergo») в начале игры Assassin's Creed II, тамплиеры построили специальный объект, содержащий в себе несколько десятков устройств «Анимус». Этот объект служит полигоном для подготовки новобранцев ордена с целью ликвидации Ордена Ассасинов. Тамплиеры намерены использовать технику и приспособления своих противников, используя воспоминания самых квалифицированных ассасинов. В мультиплеере будут представлены несколько игровых персонажей-классов: Куртизанка (англ. Courtesan), Охотник (англ. Hunter), Парикмахер (англ. Barber), Палач (англ. Executioner); Дворянин (англ. Noble); Священник (англ. Priest), Доктор (англ. Doctor), Торговец (англ. Merchant), Кузнец, Солдат, Арлекин (англ. Harlequin), контрабандистка, у каждого из которых имеется своя особая техника убийства и свой комплекс навыков и оружия. В игре присутствуют несколько различных режимов мультиплеерной игры. На данный момент подтверждён режим «Розыск» (англ. «Wanted»), в котором участвуют от 6 до 8 человек на небольшой карте, где каждый игрок преследует другого (подобно основанной на такой механике игре The Ship). В начале раунда каждый игрок получает определённую замаскированную цель, которую надо уничтожить; при этом, сам игрок так же является чьей-то целью. На каждой карте будут находиться управляемые компьютером NPC, под которых и маскируются игроки, выбирая свой игровой класс. Мультиплеер игры осуществляется через игровые сети Xbox Live, PlayStation Network. Также появились в сети новые подробности о мультиплеере: существует 21 класс - 10 начальных, 5 бонусных, 2 платных, а также 4 класса из дополнения «The Da Vinci Disappearance».
